LAUSR

The ubiquitous second messenger 3',5'-cyclic Adenosine Monophosphate (cAMP) regulates the cardiac Excitation-Contraction Coupling (ECC) by acting in discrete subcellular microdomains. Phosphodiesterase (PDE) subfamilies 4B and 4D are critically involved in the regulation of cAMP signaling in mammalian Cardiomyocytes (CMs). Alterations in PDE4 activity in human hearts have been shown to result in arrhythmia and heart failure. In this work, the specific roles of PDE4B and PDE4D in the regulation of cAMP dynamics in three distinct subcellular microdomains were investigated. Microdomains of interest were formed around the caveolin-rich plasma membrane which harbors the L-Type Calcium Channel (LTCC), Sarco/Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase 2a (SERCA2a) and the cardiac Ryanodine Receptor Type 2 (RyR2). Transgenic mice expressing Foorster Resonance Energy Transfer (FRET)-based cAMP specific biosensors targeted to caveolin-rich plasma membrane, SERCA2a and RyR2 microdomains were crossed with PDE4B-KO and PDE4D-KO mice. By performing FRET imaging in ventricular CM isolated from adult wild type and PDE4B-KO or PDE4D-KO mice, a direct analysis of the specific effects of both PDE subfamilies was performed. The data demonstrate that all microdomains are differentially regulated by these two PDEs. Even within one organelle, such as the sarcoplasmic reticulum, we could show the co-existence of at least two distinct cAMP microdomains formed around RyR2 and SERCA2a which are preferentially controlled by PDE4B and PDE4D, respectively. This correlated with local cAMP-dependent Protein Kinase A (PKA) substrate phosphorylation and arrhythmia susceptibility. Stimulated Emission Depletion (STED) microscopy of immunostained CM suggested possible co-localization of PDE4B with both sarcolemmal and RyR2 microdomains. Using live cell imaging, it could be confirmed that PDE4D is involved in the regulation of cAMP dynamics at SERCA2a and at the caveolin-rich plasma membrane. In contrast to previous reports, we provide evidence that PDE4B is regulating not only LTCC associated compartments but is also directly involved in the RyR2 microdomain. Der universelle second messenger 3',5'-cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) reguliert die kardiale elektromechanische Kopplung, indem es in eigenstandig regulierten subzellularen Mikrodomanen wirkt. Die Unterfamilien 4B und 4D der Phosphodiesterase sind masgeblich an der Regulation der cAMP Signalweiterleitung in Saaugetierkardiomyozyten beteiligt. Es konnte gezeigt werden, dass Schwankungen der PDE4 Aktivitat im menschlichen Herzen zu Arrhythmien und Herzversagen fuuhren. Das Ziel dieser Arbeit war die systematische Untersuchung der Einflusse von PDE4B und PDE4D auf die Regulation der cAMP Signalweiterleitung in drei subzellularen Mikrodomanen, die um die Calcium handling Proteine lokalisiert sind. Untersucht wurde die Regulation der Mikrodomanen um den L-Typ-Calciumkanal (LTCC), die Calciumpumpe des sarcoplasmatischen und endoplasmatischen Reticulums (SERCA2a) und die kardialen Ryanodin Rezeptoren Typ 2 (RyR2), sodass deren Auswirkungen auf Herzfunktionen und -erkrankungen besser verstanden werden konnen. Transgene Mause, die Forster Resonanz Energy Transfer (FRET) basierende cAMP spezifische Biosensoren in den Mikrodomanen der Caveolin reichen Plasmamembran, der SERCA und des RyR2 exprimieren, wurden mit globalen PDE4B und PDE4D knockout Mausen gekreuzt. Durch FRET Mikroskopie in adulten ventrikularen Kardiomyozyten, die aus Wildtyp und PDE4B und PDE4D knockout Mausen isoliert wurden, konnten spezifische Aussagen uber den Einfluss beider PDE Unterfamilien auf diese Mikrodomanen getroffen werden. Die Ergebnisse zeigen, dass alle Mikrodomanen unterschiedlich von PDE Unterfamilien reguliert werden. Selbst innerhalb einer Organelle, dem sarkoplasmatischen Retikulum, konnte die Koexistenz von mindestens zwei verschiedenen cAMP-Mikrodomanen gezeigt werden, die um den RyR2 und der SERCA2a lokalisiert sind und von PDE4B bzw. PDE4D kontrolliert werden. Dies korreliert mit der lokalen Proteinkinase A (PKA) abhangigen Phosphorylierung des Phospholamban (PLN) und des RyR2 sowie der Neigung des Herzens zu Arrhythmien. Stimulated Emission Depletion (STED) Mikroskopie von immungefarbten Kardiomyozyten starkt die Annahme einer Kokokalisation von PDE4B sowohl mit der Sarkolemma- als auch mit der RyR2 Mikrodomane. Mittels Live Cell Imaging konnte bestatigt werden, dass PDE4D an der Regulation der cAMP Signalweiterleitung in der Caveolin reichen Plasmamembran und der SERCA2a Mikrodomane beteiligt ist. Im Gegensatz zu fruheren Publikationen konnte gezeigt werden, dass PDE4B nicht nur in der LTCC Mikrodomane vorhanden, sondern auch direkt an der Regulation des RyR2 beteiligt ist.